攘夷派木户孝允、高杉晋作等人手中，长州开始实行倒幕割据政策。幕府策划第二次征讨长州。本来萨摩曾在禁门之变、第一次征讨长州的战争中多次与长州兵戎相见，这时却因长州通过萨摩购买英国武器而逐渐与之接近。大久保利通早年即有“一国割据”思想，此时看到它以另一种形式在长州实现。便逐渐转变为倒幕派。1866年2月，萨长两藩在坂本龙马、中冈慎太郎的斡旋下，结成了倒幕同盟，萨摩藩与德川庆喜的友好关系从此中断。为确保倒幕成功，大久保利通与朝廷公卿岩仓具视合作，利用天皇权威，于1868年1月3日成功发动宫廷政变。朝廷发布的“王政复古大号令”。废除了朝廷的摄政、关白制度与幕府的征夷大将军。随后朝廷的军队击败进至京都郊外的幕府军队，在此后的戊辰战争中消灭了幕府。大久保利通则担任参谋后又任总裁局顾问处理内务，协助西乡指挥作战，从而建立并巩固了明治新政权。
以天皇为首的朝廷在倒幕过程中的微妙作用。给大久保利通以很深的印象。他断定，为了领导日该国，天皇必须首先“一新”朝廷之旧弊，为此就必须使天皇与象征旧弊的京都割断联系。创造适应新时代的天皇性格。明治政府成立后的迁都、改元等都反映了他这种思想。